色譜法的幾種常見類型448
發(fā)表時(shí)間：2020-12-14 09:00 色譜法是一種分離分析技術(shù)，通過將樣品中的組分分離，再逐個(gè)分析，因此是分析混合物、檢測化合物純度的有力手段，因而在藥物研發(fā)中廣為應(yīng)用，包括原料藥、中間體、制劑和生物體液中化合物的定性和定量，涉及的待測物包括手性或非手性藥物、過程雜質(zhì)、殘留溶媒、附加劑（如防腐劑）、分解產(chǎn)物、從容器和密閉包裝或制造過程中帶入的雜質(zhì)、植物藥中的農(nóng)藥和代謝物等，包括制備工藝研究、中間體控制、質(zhì)控檢驗(yàn)、穩(wěn)定性及藥物動(dòng)力學(xué)研究等過程。因此，色譜方法在藥物研發(fā)中占據(jù)舉足輕重的地位。 一 色譜法的幾種常見類型 1、HPLC法： 1 手性液相色譜 將“手性識(shí)別”或“手性環(huán)境”引入色譜系統(tǒng)中，以形成暫時(shí)非對映異構(gòu)體復(fù)合物，從而直接分離藥物對映體；或?qū)τ丑w衍生化生成非對映體，而得以分離。即分離光學(xué)異構(gòu)體可用手性固定相、衍生化后在非手性固定相上或在非手性固定相上用流動(dòng)相手性添加劑形成非對映體來實(shí)現(xiàn)。 2 離子交換色譜 使用表面有離子交換基團(tuán)的離子交換劑作為固定相。帶負(fù)電荷的交換基團(tuán)（如磺酸基和羧酸基）可以用于陽離子的分離；帶正電荷的交換基團(tuán)（如季胺鹽）可以用于陰離子的分離。不同離子與交換基的作用力大小不同，在樹脂中的保留時(shí)間長短不同，從而被相互分離。可用pH程序洗脫。 3 離子對/親和色譜 常用反相離子對色譜，用緩沖液和加入的對離子（與被分離的樣品荷相反電荷）分離。分離受pH、離子強(qiáng)度、溫度、濃度和共存的有機(jī)溶劑類型的影響，親和色譜，一般用于大分子，使用配合體（共價(jià)結(jié)合在固體基質(zhì)上的生物活性分子），與其同類的抗原（分析介質(zhì)）反應(yīng)，生成可逆轉(zhuǎn)的復(fù)合物，通過改變緩沖條件洗脫。 4 正相色譜 將各種不同的有機(jī)官能團(tuán)通過化學(xué)反應(yīng)共價(jià)結(jié)合到固定相惰性載體上，固定相極性＞流動(dòng)相極性。常用固定相：二醇基、醚基、氰基、氨基等極性基團(tuán)的有機(jī)分子。適于分離水溶性的極性、強(qiáng)極性化合物，此時(shí)較小極性的組分比較大極性組分更快地洗脫。 5 反相色譜 將各種不同的有機(jī)官能團(tuán)通過化學(xué)反應(yīng)共價(jià)結(jié)合到固定相惰性載體上，固定相極性＜流動(dòng)相極性。常用固定相：烷基、苯基等非極性有機(jī)分子，最常用ODS柱或C18柱，其極性很小，適于分離非機(jī)性、弱極性離子型樣品。是目前藥物研發(fā)中液相色譜的主要分離模式，通常用紫外檢測器，用水作基本溶劑，選擇性受溶劑強(qiáng)度、柱溫和pH的影響，一般來說較大極性比較小極性組分洗脫更快。 紫外檢測器可以用于各類液相色譜，這類檢測器要注意的是氘燈老化后的靈敏度降低，其靈敏度因儀器的設(shè)計(jì)和/或者制造廠家的不同而異。用紫外檢測器和反相HPLC組合得到的色譜圖不一定能真實(shí)的反映實(shí)際情況，原因是：①極性比目標(biāo)化合物大得多的化合物可能被掩蓋（在溶劑前沿或死體積時(shí)同時(shí)洗脫）；極性比目標(biāo)化合物小得多的化合物洗脫出來晚，甚至保留在柱上。為避免此情況發(fā)生，最好使用梯度洗脫法。②無紫外吸收或在檢測波長處吸收相差較大的多種化合物，有時(shí)在某一檢測波長處不能被檢出，因?yàn)橥ǔＶ挥靡粋€(gè)檢測波長。為避免此情況發(fā)生，可改用其它類型檢測器，如示差折光檢測器；流動(dòng)相許可時(shí)，最好使用蒸發(fā)光散射檢測器。 6 分子排阻色譜 以多孔凝膠（如葡萄糖，瓊脂糖，硅膠，聚丙烯酰胺等）作固定相，依據(jù)樣品分子量大小達(dá)到分離目的。大分子不進(jìn)入凝膠孔洞，沿多孔凝膠膠粒間隙流出，先被洗脫；小分子進(jìn)入大部分凝膠孔洞，在柱中被滯留，后被洗脫。
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